Korkean erotuskyvyn nestekromatografia

Korkean erotuskyvyn nestekromatografia, josta yleisimmin käytetään lyhennettä HPLC (engl. High Performance Liquid Chromatography), on kromatografinen menetelmä, jota käytetään yhdisteiden erottamiseen, tunnistamiseen ja kvantitatiiviseen analysointiin. HPLC-analytiikasta on tullut yksi yleisimmistä kemiallisen analytiikan instrumentaalisista menetelmistä ja sillä on laajat käyttösovellukset lähes kaikilla kemian aloilla.

HPLC

Toimintaperiaate

HPLC-laitteistossa liuottimeen liuotettu näyte pakotetaan kulkemaan ohuen putken eli kolonnin läpi, joka on pakattu tiiviisti hienojakoisella kiinteällä faasilla. Yhdisteiden erottuminen korkean erotuskyvyn nestekromatografiassa perustuu yhdisteiden vuorovaikutukseen kiinteän stationäärifaasin ja liikkuvan nestemäisen faasin välillä. Erottuneet yhdisteet havaitaan detektorilla, jonka avulla yhdisteitä voidaan esimerkiksi tunnistaa sekä määrittää niiden pitoisuuksia näytteessä.

Laitteisto

HPLC-laitteisto

HPLC-laitteisto koostuu yksinkertaisimmillaan liuossäiliöstä, korkean paineen tuottavasta liuospumpusta, kolonnista ja detektorista. Modernin HPLC-laitteiston kokoonpano voi sisältää myös esimerkiksi liuosten kaasunpoistoyksikön, seospumpun, automaattisen näytteensyöttäjän, kolonniuunin ja datan käsittely-yksikön (tietokoneen).

Kolonni on osa, jossa yhdisteiden erottuminen tapahtuu. Kolonni on teräs- tai polymeeriputki, joka on tiiviisti pakattu hyvin hienojakoisella kiinteällä aineella, jota kutsutaan stationaarifaasiksi. Stationaarifaasin koostumus vaihtelee käyttösovelluksesta riippuen. Stationäärifaasin laatu määrää, onko kyseessä käänteisfaasi-, normaalifaasi-, ioninvaihto- vai ekskluusiokromatografia. Yleisin stationaarifaasin materiaali on silika tai kemiallisesti modifioitu silika. Kemiallisesti modifioidussa silikassa silikaan on kiinnitetty jokin kemiallinen ryhmä, kuten syano-, amino-, dioli, nitro-, fenyyli-, C18-, C8-, tai C2-ryhmä. Myös muita materiaaleja voidaan käyttää, kuten alumiinioksidia.

Pumppu HPLC -laitteistossa pystyy tuottamaan tyypillisesti yli 300 bar korkean paineen, jota tarvitaan liuottimen pumppaamiseen tiivisti pakatun stationaarifaasin läpi. Yleensä pumpuilla voidaan myös tuottaa hyvin tarkasti kahden tai useamman liuottimen seoksia siten, että liuosten tilavuussuhteita voidaan analysoinnin aikana portaattomasti muuttaa. Tätä kutsutaan gradienttiajoksi. Isokraattisessa ajossa liuoskoostumus pysyy samana koko ajon ajan.

Detektori on laite, jolla kolonnissa erottuneet yhdisteet voidaan havaita. Yleisimmin käytetyt detektorit perustuvat valon absorbanssin, taitekertoimen, johtokyvyn tai muun sähkökemiallisen ilmiön, fluoresenssin tai massaspektrin mittaamiseen. Detektori tuottaa yhdisteen havaitessaan jonkin mitattavissa olevan vasteen, jonka avulla yhdiste voidaan mahdollisesti tunnistaa tai sen määrä liuoksessa voidaan mitata.