Ero sivun ”Polymeraasiketjureaktio” versioiden välillä

[katsottu versio][katsottu versio]
Poistettu sisältö Lisätty sisältö
ohjaa tänne -malline, luokka, muita PCR-menetelmiä
Merkkaus: Linkki täsmennyssivulle
lähde
Rivi 2:
[[Tiedosto:PCR tubes.png|thumb|Kahdeksan PCR-putken ”strippi”.]]
[[File:PCR.svg|thumb|Polymeraasiketjureaktion vaiheet.]]
'''PCR''' eli '''polymeraasiketjureaktio''' ({{k-en|polymerase chain reaction}}) on yksi tärkeimmistä [[molekyylibiologia]]n menetelmistä, jolla esimerkiksi yksittäinen geeni tai mikä tahansa [[DNA]]-pätkä voidaan monistaa [[eksponentiaalinen|eksponentiaalisesti]]. PCR suoritetaan elävien solujen ulkopuolella laboratoriossa ([[in vitro]]), käyttäen erityistä PCR-laitetta. PCR:n avulla hyvin pienestä DNA-määrästä saadaan muutamassa tunnissa monistettua miljardikertainen määrä samaa DNA:ta.<ref name=":0">{{Kirjaviite|Tekijä=Virtanen, Ismo & Vuorio, Eero|Nimeke=Solu- ja molekyylibiologia|Vuosi=1995|Sivut=53 - 54|Julkaisupaikka=Porvoo|Julkaisija=Weilin+Göös & WSOY|Tunniste=|Isbn=951-35-5685-9|www=|Viitattu=2022-11-07}}</ref>
 
PCR-tekniikkaa käytetään moniin tarkoituksiin, muun muassa [[perinnöllinen sairaus|perinnöllisten sairauksien]] etsimiseen, yksilöiden tunnistamiseen [[DNA-profilointi|geneettisten sormenjälkien]] avulla, [[infektiosairaus|infektiosairauksien]] diagnosointiin ja geenien [[kloonaus|kloonaamiseen]].<ref>{{Verkkoviite | Osoite = http://www.edu.fi/oph/abc/dna/pcr.html| Nimeke =Polymeraasiketjureaktio | Tekijä =Suominen, I. & Ollikka, P. | Tiedostomuoto = | Selite = | Julkaisu = | Ajankohta = | Julkaisupaikka = | Julkaisija =Opetushallitus | Viitattu =5.11.2007 | Kieli = }}</ref><ref name="cp 15.0.1"> [http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471142720/cp/cpmb/article/mb1500/current/pdf ''Current Protocols'', s. 15.0.1]</ref>
Rivi 33:
 
# [[Denaturoituminen|Denaturaatiovaihe]] ({{k-en|denaturation}}) (94–98 °C)
# [[Aluke (molekyylibiologia)|Alukkeiden]] liittymisvaihe ({{k-en|annealing}}) (45–72 °C)
# Pidentymisvaihe l. elongaatio- tai ekstensiovaihe ({{k-en|elongation, extension}}) (72 °C)
 
Rivi 40:
[[Tiedosto:PCR basic principle1.jpg|thumb|none|450px|DNA:n monistuminen ja PCR:n lämpötilaprofiili. 1': Alkudenaturaatio ja 1: Denaturaatiovaihe jossa DNA:n vastinjuosteet irtoavat toisistaan. (94–96 °C) 2: Alukkeiden kiinnittyminen (45–65 °C). 3: Pidentyminen (72 °C). Kuvan neljästä syklistä jokainen kaksinkertaistaa DNA:n määrän.]]
 
Denaturaatiovaiheessa reaktioseos kuumennetaan 94–98 °C:een noin 30 sekunnin tai pisimmillään yhden minuutin ajaksi riippuen käytettävän DNA-templaatin kompleksisuudesta, jolloin. DNA denaturoituu ja sen vastinjuosteet irtoavat toisistaan korkean lämpötilan vaikutuksesta<ref name=":0" />. Reaktion ensimmäisenä vaiheena voidaan usein myös käyttää niin kutsuttua alkudenaturaatiota, jossa lämpötila nostetaan 94-98 asteeseen kahdeksi minuutiksi. Tämän vaiheen tarkoituksena on varmistaa kaikkien DNA-molekyylien täydellinen denaturaatio.
 
Alukkeiden liittymisvaiheessa PCR-reaktioseoksen lämpötila lasketaan<ref name=":0" /> alukkeiden nukleotidisekvenssistä riippuen noin 45–65 °C:een. Lämpötila on riippuvainen alukkeiden ''sulamislämpötilasta'' (''T<sub>m</sub>''), joka puolestaan on suoraan verrannollinen alukkeen emäskoostumukseen. Liittymisvaiheessa tutkittavalle DNA-kohdalle spesifiset alukkeet kiinnittyvät yksisäikeiseen DNA:han emäsparisäännön mukaisesti. Koska DNA-polymeraasi vaatii alukkeen läsnäolon DNA-juosteessa ennen kuin se voi aloittaa toimintaansa, rajaavat alukkeet siten monistettavan alueen.
 
Ekstensiovaiheessa DNA-polymeraasi aloittaa vastinjuosteen luomisen yksisäikeiselle DNA:lle. Pidentymisvaihe tapahtuu useimmiten 72 °C:ssa, joka on monien polymeraasientsyymien optimaalinen toimintalämpötila. Pidentymisvaiheen kesto määritetään haluttavan PCR-tuotteen pituuden ja kompleksisuuden mukaan. Näitä syklejä toistetaan useita, keskimäärin noin 25–45 kappaletta, joiden jälkeen suoritetaan vielä noin kymmenen minuutin pituinen loppuekstensio samassa lämpötilassa. Loppuekstension tarkoituksena on varmistaa, että polymeraasientsyymi rakentaa kaikki aloitetut DNA-kopiot loppuun asti. Koska DNA:n määrä kaksinkertaistuu jokaisessa syklissä, niin esimerkiksi 28 syklin kuluttua yhdestä DNA molekyylistä on näin tuotettu 2<sup>28</sup> eli noin 270 miljoonaa kopiota.<ref name="cp 15.0.1"/>