MitokondrionaalisessaMitokondriaalisessa beta-oksidaatiossa saadaan tuotettua [[Adenosiinitrifosfaatti|ATP:ta]] solun energiatarpeen tyydyttämiseksi. Aluksi vapaa rasvahappo aktivoidaan [[mitokondrio]]n ulkokalvolla, jossa rasvahappo liitetään [[koentsyymi A]]:han muodostaen asyyli-CoA:n. Tämä on ainoa vaihe lipolyysissä, joka kuluttaa energiaa. Koska pitkäketjuiset rasvahapot eieivät pysty läpäisemään mitokondrion sisäkalvoa, asyyli-CoA muokataan [[karnitiiniasyylitransferaasi I]]:n katalysoimassa reaktiossa [[karnitiini]]n kanssa asyylikarnitiiniksi, joka viedään vaihtokuljettajan avulla mitokondrion matriksiin sisään samalla kun karnitiinia kuljetetaan vastakkaiseen suuntaan ulos. Matriksissa asyylikarnitiinista tehdään taas asyyli-CoA vaihtoreaktiolla, jolloin karnitiini vapautuu käytettäväksi uudestaan. Tämä kuljetustapahtuma on lipolyysin tärkein säätelykohta, jossa karnitiiniasyylitransferaasi I:tä inhiboi lipogeneesin välituote malonyyli-CoA.
Varsinaisessa beta-oksidaatiossa rasvahapot hajotetaan kahden hiilen mittaisiksi [[Asetyyli-koentsyymi-A|asetyyli-CoA-yksiköiksi]] pilkkomalla ne asyyli-CoA:sta. Nämä viedään edelleen [[sitruunahappokierto]]on ATP:n fosforyloimiseksi ADP:sta. Jäljelle jääneen asyyli-CoA:n pilkkomista jatketaan, kunnes jäljelle jää parillisista rasvahapoista kaksihiilinen asetyyli-CoA tai parittomista rasvahapoista kolmihiilinen propionyyli-CoA, jotka myöskin ohjataan sitruunahappokiertoon. Mikäli elimistö ei pysty runsasrasvaisen aterian jälkeen käyttämään kaikkea tuotettua asetyyli-CoA:ta sitruunahappokierron rajallisen kapasiteetin vuoksi, ne ohjautuvat [[ketogeneesi]]in muokattavaksi [[ketoaine]]iksi.
Esimerkiksi [[palmitiinihappo|palmitaatin]] tapauksessa beta-oksidaatio kestää seitsemän kierrosta, ja energiaa vapautuu 108 ATP-yksikköä. Koska beta-oksidaation aktivointi kuitenkin kuluttaa 2 ATP-yksikköä energiaa, nettotuotoksi jää 106 ATP-yksikköä.
